Xây dựng quy trình giải trình tự Sanger khảo sát năm biến thể trên các gen PNPLA3, TM6SF2, MBOAT7 và GCKR liên quan đến bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tối ưu hóa quy trình ly trích DNA có ly giải hồng cầu bằng dung dịch ACK, thiết kế 5 cặp đoạn mồi đặc hiệu cho các biến thể, tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp của phản ứng PCR và tối ưu hóa phản ứng giải trình tự Sanger trên hệ thống Applied Biosystems 3500 (ThermoFishser). Áp dụng toàn bộ quy trình giải trình tự Sanger đã tối ưu lên 4 mẫu máu của người tình nguyện nhằm đánh giá thông số kỹ thuật và đặc điểm của các biến thể. Kết quả: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự Sanger bao gồm: tối ưu hóa được lượng thể tích (4 ml) và thời gian ly giải hồng cầu với ACK (10 phút) để thu được DNA có độ tinh khiết đạt chuẩn, thiết kế được năm cặp đoạn mồi khuếch đại đặt hiệu năm biến thể quan tâm. Khảo sát DNA 4 người tình nguyện khỏe mạnh, tất cả đều có ít nhất một trong năm biến thể quan tâm, với tất cả kết quả giải trình tự có tỉ lệ nucleotide có độ chính xác cao-QVB > 90%. Kết luận: Đã xây dựng và tối ưu quy trình giải trình tự Sanger xác định biến thể đa hình đơn nucleotide. Bước đầu áp dụng quy trình trên người tình nguyện, làm cơ sở cho các khảo sát với cỡ mẫu đại diện giúp tiếp cận và quản lý ở phương diện phân tử NAFLD ở Việt Nam.
Develop Sanger sequencing and investigate five variants on PNPLA3, TM6SF2, MBOAT7 and GCKR genes related to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Materials and methods: Optimized the DNA extraction process with erythrocyte lysis by ACK solution, designed 5 pairs of primers specific for variants, optimized the pairing temperature of the PCR reaction and optimized Sanger sequencing reaction on an Applied Biosystems 3500 Series Genetic Analyzer from Thermo Fishser. Apply the entire optimized Sanger sequencing process to 4 blood samples of volunteers to evaluate the specifications and characteristics of the variants. Results: Successfully built Sanger sequencing process including: optimization of erythrocyte volume and lysis time with ACK to obtain DNA of standard purity, designing 5 pairs of primers effectively amplifying the five variants of interest, optimizing the concentration of DNA participating in the sequencing reaction. Obtained 4/4 participants with at least one of the 5 variants of interest with all sequencing results having a QVB > 90%. Conclusion: Established and optimized Sanger sequencing to identify single nucleotide polymorphisms. Initially applying the process on volunteers, as a basis for surveys with representative sample sizes to approach and manage NAFLD in molecular perpestive in Vietnam.
- Đăng nhập để gửi ý kiến